行研分子诊断系列Sanger测序基因分析
一、新冠疫情来袭分子诊断脱颖而出
近年来，国内分子诊断市场增长迅猛。根据智研咨询发布的《-年中国分子诊断行业市场深度调研及投资战略研究报告》，国内体外诊断市场规模在年后保持着20%的增速，年约亿人民币，年叠加新冠疫情影响，实际市场规模超亿元。
新冠疫情之下，准确快速、性价比高的分子诊断检测技术在公共卫生事件处理方案中呈现重大意义和快速增长。qPCR技术以其快速、准确、易实现的优点成为疫情诊断方案的首选。伴随着核酸检测的巨大市场需求空间出现，分子诊断行业一跃成为IVD增长最快的领域。过去几年，分子诊断已经呈现20%左右的增长率；而近两年，分子诊断行业更是处于高景气度，市场高速爆发成长。数据显示，年我国分子诊断行业的市场规模约81.7亿元，国内分子诊断市场占体外诊断市场比例从年的8.26%增长至年的15.8%，年有望突破20%，成为名副其实的IVD领域生力军。
分子诊断是指利用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的结构或表达水平的变化而做出诊断的技术，广泛用于肝炎、性病、肺感染性疾病、优生优育、遗传病基因、肿瘤等领域，主要有核酸扩增技术(PCR，聚合酶链式反应)、原位杂交技术(FISH)、基因芯片和基因测序四大类。
我国国内产品在核酸检测中的定量荧光PCR技术已基本达到国际水平，基因芯片技术和肿瘤基因检测技术也已接近国际水平。
PCR技术受限于检测位点单一，劣势是无法实现多个靶标基因同时检测，其多重联合检测最多检测三个靶标，可同时涵盖的基因位点数量较有限。
基因测序技术虽市场占有率低，但发展迅猛，二代测序（NGS）技术由于实验操作复杂、设备成本高等原因，在临床应用中仍处于起步阶段。
基于Sanger基因测序分析技术的基因分析仪不仅可以进行基因序列分析，还可以快速实现单次检测多靶标(10-60重)基因的目的。中通量、多基因联检及快速自动化的基因分析整体解决方案，已成为未来分子诊断市场的重要发展方向。
二、基因测序技术发展波澜壮阔40年
1、基因测序技术发展史
自年DNA（脱氧核糖核酸）分子的双螺旋结构被发现以来，生物学研究进入到了更精细化的分子时代。年，英国生化学家FrederickSanger发明了末端终止法DNA测序技术，人类第一次真正看到了生命最基本信息的样子。从年Sanger牛刀小试的双脱氧终止法到高通量二代测序技术，再到单分子测序技术，跨越了40多年的风雨历程。
图表1基因测序技术发展史
目前基因测序技术已经发展至第四代，其中第二代NGS基因测序技术应用最为广泛。
第一代基因测序法即Sanger法测序，年Sanger引入ddNTP（双脱氧核苷三磷酸），发明了著名的双脱氧链终止法，又称“Sanger法”，于年与另外两名科学家共享诺贝尔化学奖。双脱氧链终止法有效控制了化学降解法中化学毒素和同位素的危害。
根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定碱基处终止，且在每个碱基后面进行荧光标记产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的系列核苷酸，然后在尿素变性聚丙烯酰胺（PAGE）胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列。
Sanger法基本原理是脱氧核苷酸三磷酸ddNTP的2’和3’均不含羟基，故在核酸链合成的过程中不会形成磷酸二酯键，从而中断DNA合成。通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测，根据电泳条带的位置可以确定待测分子的DNA碱基序列。
图表2Sanger法测序基本原理
第二代基因测序技术即NGS测序，又称高通量测序技术(high—throughputsequencing,HTS)，被称为下一代测序（Next-generationsequencing，NGS），是基于PCR和基因芯片发展而来的DNA测序技术。核心是边合成边测序或边连接边测序，通过物理或化学的方式将模板DNA随机打断成小片段并通过PCR对文库进行扩增，同时对几十万到几百万条DNA模板进行测序，最后通过生物信息学分析将小片段拼接成长片段。
第三代基因测序技术也叫从头测序技术，即单分子实时DNA测序。DNA测序时，不需要经过PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序。单分子实时荧光测序技术，应用了边合成边测序的思想，并以SMRT芯片为测序载体，芯片上有很多小孔，每个孔中均有DNA聚合酶。测序基本原理是：DNA聚合酶和模板结合，4色荧光标记4种碱基（即是dNTP），在碱基配对阶段，不同碱基的加入，会发出不同光，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。
第四代基因测序技术为纳米孔单分子测序技术，基于电信号的纳米孔单分子测序技术，在多聚合物膜上布满穿膜孔的跨膜通道蛋白（纳米孔）的基础上，由DNA马达蛋白牵引，解旋成单链的核酸匀速通过纳米级的孔蛋白。在孔蛋白两侧施加的电压作用下，不同的碱基会形成特征性离子电流变化信号，经过后期对电信号的采集、处理、分析来识别碱基。
图表3各代基因测序仪的发展
2、各代测序技术特点纷呈应用场景各异
各代测序技术的原理因其各自技术路线的特点不同，适用范围和应用场景也不尽相同。在各自的应用场景，并非替代关系，而是优势互补，各有千秋。
第一代测序技术为合成终止测序，主要特点是测序读长可达bp，准确性高99.%，但其测序成本较高、通量较低低，曾影响了其大规模的应用。一代测序一直以来因为其可靠性和准确性高等被广泛应用，但不足是检测周期长，因此缩短检测时间成为技术的改进方向。
第一代测序技术凭借其长的序列片段和高的准确率，适合对新物种进行基因组长距框架的搭建以及后期GAP填补，但是成本较高，而且难以胜任微量DNA样品测序工作。
二代测序是一个强大的功能平台，可同时给数以万计的DNA分子进行测序。大大降低了测序成本的同时，还大幅提高了测序速度，保持了高准确性，可以总结为通量大、速度快，但在序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多。第二代测序技术的序列片段最长，比较适合对未知基因组从头测序，搭建主体结构，但是在判断连续单碱基重复区时准确度不高。Solexa较具有通量高、片段短、价位低的特点，可以用于大基因组和小基因组的测序和重测序。Solexa双末端测序(paired-endsequencing)可以为基因组进一步拼接提供定位信息，但是随着反应轮数增加，序列长度和质量均有所下降，而且在阅读AT区时有明显错误倾向。SOLiD基于双碱基编码系统的纠错能力以及较高的测序通量，适合转录本研究以及比较基因组学特别是SNP检测等，但是测序的片段短限制了该技术在基因组拼接中的广泛应用。
图表4二代基因测序仪（NGS）各技术路线一览
第三代测序技术是为了解决第二代所存在的缺点而开发的，根本特点是单分子测序，不需要任何PCR的过程，能有效避免因PCR偏向性而导致的系统错误。第四代测序技术相比于第三代技术通量有所提高且准确率也有所上升，仪器更小，第三、四代测序技术目前主要用于科学研究，临床应用还需技术进一步的成熟。
第三代和第四代测序技术主要应用在基因组测序、甲基化研究、和突变鉴定（SNP检测）三个方面。目前，该技术还不成熟，需要继续改进，尤其是测序准确率有待提高（均在90%以下），但其具有测序时长长、测序时间短、试剂消耗少、测序信息丰富、测序过程简单等优势。
三、全球测序仪市场被外资公司垄断
国产测序仪正努力实现突破
随着基因测序技术从科研走向临床，生命科学时代已经到来。基因测序市场从年的7.94亿美元增长到年的59亿美元，年复合增长率为28.5%。预计未来几年依旧会保持快速增长，-年复合增长率为18.5%。
图表5-全球基因测序市场规模
中国基因测序行业基数较小，但增速全球领先。我国基因检测行业的整体规模在年为31.8亿元，年上涨至亿元，7年增长至原来的近五倍，复合年平均增长率25.7%，预计到年，总规模将突破亿元。
图表6-中国基因检测市场规模
1、产业链核心是上游测序仪的生产制造
基因测序产业链的上游是基因测序相关仪器、耗材及试剂供应商，提供基因测序平台和解决方案。中游是以实验室、研究机构、测序服务公司为代表的服务提供商，其构建大规模测序平台，并为其他用户提供测序，开发基因测序相关应用。下游是以政府、药企、医院以及广大人群为代表的测序相关应用或服务的终端消费者。
基因测序仪是测序产业链的起点也是关键环节，它为整个中下游测序服务提供最基本的测序支撑，同时也是壁垒最高的部分，处于基因测序产业价值链顶端。基因测序仪对于基因测序行业的重要性，如同发动机之于汽车行业，芯片之于电子通信行业，可谓是基因测序行业“皇冠上的明珠”。
图表7基因测序产业图谱
2、国产测序仪努力实现突破
NGS基因测序仪市场
根据中国产业信息网的统计数据，目前全球范围内的NGS基因测序仪不足台，分布于60多个国家和地区，其中Illumina市场份额占比高达83.9%；ThermoFishe（赛默飞）市场份额占到9.9%；Roche市场份额占比5.3%。Illumina和ThermoFisher设备占比超过90%，上游基因测序设备制造已形成垄断。
华大基因在年以1.亿美元收购美国的CompleteGenomics（CG公司），并以CG公司的技术为基础，打造自主知识产权的基因测序仪。经过数年的内部孵化，年4月，深圳华大智造科技股份有限公司注册成立，华大智造的DNA纳米球与联合探针锚定聚合相结合的技术路线逐步成熟，并推出了MGISEQ-、BGISEQ-、MGISEQ-0、MGISEQ-T7等测序仪，与Illumina和ThermoFisher在全球范围内同台竞技。
根据华大智造招股说明书披露的内容，华大智造在年至年9月期间合计销售基因仪台，一定程度上打破了外资公司的垄断。
图表8华大智造-年9月销售数据
来源：华大智造招股说明书
虽然华大智造发展迅猛，但是在测序仪器几乎被寡头垄断的环境下，下游应用企业购买仪器运行所需的耗材和试剂时基本上不具有议价能力，而且换用测序设备需要将整个已经建成的体系全部推倒，然后在新的平台上进行重新构建，更换全套体系的迁移成本不容忽视。
基于Sanger测序原理的基因分析仪市场
基因分析仪主要基于毛细管电泳分析及Sanger技术平台，经过数十年结果的验证，Sanger测序是DNA测序的金标准，此外，多重片段分析也广泛应用于多个领域。
Sanger测序的工作流程从样本制备到最终数据分析，包括PCR扩增片段或提取质粒、分离纯化待测序的质粒或PCR扩增产物、DNA模板定量、循环测序、测序反应纯化、毛细管电泳和数据分析。
图表9Sanger测序工作流程
基因分析仪的优势是（1）使用的测序技术准确度高于二三代测序；（2）每个反应可以得到-bp的长序列，序列长度高于二代测序。劣势是（1）一个反应只能得到一条序列，测序通量低；（2）测序成本较高。
基因分析仪具有Sanger测序和片段分析两大功能。Sanger测序作为“金标准”可对已知和未知序列进行测定，可以进行病毒基因组溯源比对、HLA配型分析、基因编辑效率评价等。片段分析功能板块，可以进行基因扩增和缺失分析，DNA个体识别、疾病的辅助诊断和分类，例如可同时检测MSI、InDel、SNP、CNV、STR等常见的分子标记。
图表10基因分析仪具有Sanger测序和片段分析两大功能
因此，基因分析仪的应用可广泛应用于的靶基因测序、二代测序验证、HLA分型（骨髓移植，器官移植）、线粒体DNA测序、病原微生物测序及物种鉴定等方面。
基因分析仪的各种应用场景与领域包括肿瘤靶向药物基因突变检测、法医DNA鉴定、生殖遗传、传染病病原微生物检测、心脑血管药物指导多重基因检测、精神疾病的药物指导等。
从技术应用场景来看，基因分析是主流的身份鉴定识别技术，尤其用于司法刑侦和基因身份证。众所周知，数据涉及到个人、民族基因信息等，国产化设备能够保障基因信息数据安全；基因分析仪具有高鉴别能力、高灵敏度以及标准化分型方面的明显优势，同时成本低，使用便捷，便于精准诊断的普及，是理想的诊断平台。
公安司法领域中物证DNA鉴定的基因测序分析是标准检测手段；临床医疗领域，对于在明确靶点的用药指导及多重病原体传染病检测方向尤其检测优势明显。近年来基于该技术的分子检测试剂也迅速发展。
基因分析仪在传承CE（毛细管电泳）平台的高准确性优势的同时，实现了耗材集成化、操作智能化、设置灵活化、空间与光谱校准自动化等颠覆性技术革新，基于多色荧光通道，可检测单管多达数十个重位点，开辟了国内分子诊断行业中通量检测市场，为中国分子诊断带来全新技术变革。
由于毛细管电泳片段分析及Sanger测序设备长期被国外单一公司垄断，占据了国内市场近95%的份额，以目前国外垄断公司现有全国销售数据，年销售量稳定在-台/年。
从市场规模分析，现阶段国内公安司法及临床医疗领域根据进口设备售价及技术培训推广制约，多是省市级公安系统物证鉴定室、大型司法鉴定中医院购买了毛细管电泳片段分析Sanger测序基因分析仪。随着国产替代，设备成本大幅降低，未医院、体检机构、县级公安DNA实验室、食品安全、农业等更多领域，市场空间潜力巨大，保守估计仅基因分析仪设备市场理论测算超过75亿，加上耗材和试剂的总规模超过亿。
图表11保守估计基因分析仪市场规模
市场格局方面，目前国内市场的Sanger测序基因分析仪主要厂家有：
图表12截止年1月NMPA批准的基因分析仪/Sanger测序仪
（1）赛默飞
年，赛默飞推出型全自动遗传分析仪，实现全部操作自动化，包括自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等，标志着从平板胶进入毛细管电泳时代。随后，伴随着仪器的更新，通量逐渐提高，出现后来常见的系列、系列以及经典的3系列。其中3Dx和3xlDx基因分析仪已获得NMPA认证。年，推出最简便、自动化程度最高的一款基因分析仪SeqStudio，运行时间低至30分钟；支持在同一反应板上运行Sanger测序和片段分析；一体式卡夹耗材，即插即用；自动空间校准与光谱校准，几乎零维护。
图表13赛默飞基因分析仪系列
（2）贝克曼库尔特
SCIEX中国的GenomeLabGeXP基于毛细管电泳技术平台，可以提供流感、新冠的确诊、分型及鉴别诊断检测方案。8通道毛细管，从核酸抽提，PCR反应到毛细管电泳分离只需4-5小时。
图14贝克曼库尔特GenomeLabGeXP基因分析仪
（3）阅微基因
阅微基因的智阅基因分析仪GenReader是一款四通道基因分析系统，可支持在同一反应板上设置Sanger测序和片段分析，兼容8联管和96孔板。开放式的检测平台，可同时进行多个项目检测，使检测效率更高；创新型一体式卡夹耗材，使操作更加简单快速；精致小巧的外观，内置计算机和集成触摸屏、全中文操作系统，使运行设置更加直观灵活；自动化空间及光谱校准，使仪器几乎无需人工维护。
图15阅微基因GenReader基因分析仪
（4）海尔施基因
TSanger测序仪由毛细管电泳系统和计算机工作站组成，其与适配试剂配合使用，主要用于对临床样本中DNA或RNA进行片段分析。
图表16海尔施基因TSanger测序仪
（5）溯远基因
溯远基因研发的Classic系列基因分析仪基于Sanger测序原理，打破原有6色技术，最高支持8色荧光，有8、16、24通道可选，可应用于基因测序和片段分析，适用于基础研究、临床实验、食品安全、农业科学等多种应用场景。Classic、Classic已获得NMPA批准，可用于体外诊断。
图表17溯远基因Classic系列基因分析仪
未来，预计分子诊断技术将进入基层应用，成为生物医药、公安司法、食品安全、农业等领域必不可少的研究工具，快速准确、高性价比及结果获取快捷等特点的产品有望进一步得到广泛应用，会有越来越多分子诊断分析应用项目上市。
